Вибір середовища біофільтра для великоротого окуня- Характеристики біоплівки та продуктивність росту
Окунь великоротий (Micropterus salmoides), також відомий як каліфорнійський окунь, належить до Actinopterygii, Perciformes, Centralarchidae, Micropterus. Він походить з Каліфорнії, США, і має такі переваги, як швидке зростання, чудовий смак, багате харчування та високу економічну цінність. Він став одним із важливих видів прісноводної аквакультури в Китаї. В останні роки на тлі трансформації та модернізації рибного господарства та бурхливого розвитку цифрового та інтелектуального рибальства поступово з’явилася промислова рециркуляційна аквакультура. Режим аквакультури великоротого окуня також переходить від традиційного ставкового вирощування до екологічного та ефективного рециркуляційного режиму аквакультури. Рециркуляційна аквакультура має такі переваги, як економія води та землі, висока щільність посадки та зручне управління. За допомогою фізичних, біологічних, хімічних методів і обладнання тверді зважені тверді речовини та шкідливі речовини у водоймі видаляються або перетворюються на нешкідливі речовини, щоб якість води відповідала нормальним потребам росту культивованих видів, таким чином реалізуючи повторне використання води в умовах високо-щільності аквакультури. Він досяг хороших економічних переваг у багатьох культивованих видах.
В даний час дослідження рециркуляційної аквакультури великоротого окуня в основному зосереджені на відтворенні, поживності кормів, відборі штамів, точному годуванні, змінах водного середовища та якості харчування. Дослідження індустріалізованої рециркуляційної аквакультури великоротого окуня в закритих приміщеннях зосереджено в основному на вирощуванні великої-молоді риби, а повний-цикл вирощування дорослої риби не отримав широкого поширення. Основна проблема, з якою стикається рециркуляційна аквакультура великоротого окуня, полягає в підтримці хорошого водного середовища в умовах високої -щільності для забезпечення нормального росту культивованих видів. Очищення води є основою рециркуляційної аквакультури, а біофільтр для ефективної обробки води є основою системи водоочищення. Хоча є багато повідомлень про очищення води за допомогою біофільтруючих середовищ, звітів конкретно про промислову рециркуляційну аквакультуру великоротого окуня, особливо щодо скринінгу ефективних біофільтруючих середовищ для очищення води, структури мікробного співтовариства біоплівок на різних біофільтруючих середовищах, ефектів обробки та впливу на ріст культивованих видів, бракує. Було вибрано три типи біофільтрувальних середовищ, серед яких квадратна губка та кульковий біофільтр із псевдозрідженим шаром є низько-вартістю та простими в експлуатації та широко використовуються в очищенні хвостової води аквакультури; Mutag Biochip 30 (скорочено Biochip) — це новий тип біофільтруючого середовища, який з’явився в останні роки, має переваги ударостійкості та тривалого терміну служби, але результати його практичного застосування не повідомлялися. З цією метою технологію секвенування високої{12}}пропускної здатності 16S рДНК було використано для аналізу ситуації з утворенням біоплівки в трьох біофільтраційних середовищах для очищення води, одночасно аналізуючи ситуацію з ростом великоротого окуня, щоб відсіювати практичні біофільтраційні середовища для очищення води та забезпечити ефективне середовище для очищення води для промислової рециркуляційної аквакультури великоротого окуня.
1. Матеріали та методи
1.1 Тестові матеріали
Біофільтруючі середовища, обрані для цього тесту, буликвадратна губка, Біочіп, ікулька з псевдозрідженим шаром, як показано вмалюнок 1. Квадратний губчастий матеріал — поліуретан, має форму куба з довжиною сторони 2,0 см, питомою поверхнею (3,2~3,5)×10⁴ м²/м³. Матеріал Біочіпа — поліетилен, має форму кола діаметром 3,0 см, товщиною близько 0,11 см, питомою поверхнею 5,5×10³ м²/м³. Матеріал кульки з киплячим шаром — поліетилен, ефективна питома поверхня 500~800 м²/м³.
1.2 Експериментальне групування
Групу обробки середовищ біофільтра квадратної губки було встановлено як групу T1, відповідну біоплівку середовища було позначено B1, а відповідну воду для аквакультури було позначено W1; групу обробки середовища біофільтра Biochip було встановлено як групу T2, відповідну біоплівку середовища було позначено B2, а відповідну воду для аквакультури було позначено W2; група обробки середовищ біофільтра з кульковим псевдозрідженим шаром була встановлена як група T3, відповідна біоплівка середовища була позначена B3, а відповідна вода для аквакультури була позначена як W3.
1.3 Система аквакультури
Експеримент проводився в рециркуляційній системі аквакультури на Балідській комплексній експериментальній базі Чжецзянського інституту прісноводного рибальства.Всього було 9 культуральних резервуарів, об’ємом 500 л, ефективним об’ємом води 350 л. Резервуар біофільтра був виготовлений із пластикового акваріума розмірами 80 см завдовжки, 50 см завширшки та 50 см заввишки, об’ємом 200 л, ефективним об’ємом води 120 л.. Резервуар для культури та резервуар для біофільтра були з’єднані водяним насосом для формування внутрішньої циркуляції, швидкість потоку 3~4 л/хв, з аерацією для оксигенації, вміст розчиненого у воді кисню підтримувався вище 5 мг/л. Біофільтруючі середовища були випадковим чином згруповані, кожен тип біофільтруючих середовищ мав 3 екземпляри, кожен біофільтровий резервуар був завантажений 2,0 кг біофільтрувального середовища, одночасно суспендуючи джерело вуглецю з повільним-вивільненням. Протягом періоду культивування біоплівки щодня змінювали 10% води.Початкові показники якості води: загальний азот (TN) 9,41 мг/л, загальний фосфор (TP) 1,02 мг/л, аміачний азот (TAN) 1,26 мг/л, нітритний азот (NO₂⁻-N) 0,04 мг/л, перманганатний індекс (CODₘₙ) 3,73 мг/л.
1.4 Контроль управління рибою та культурою
В якості культивованого виду використовувався великоротий окунь. Перед початком тесту вони акліматизувалися в оборотній воді протягом 7 днів.Тестування проводилось з 11 серпня 2022 року по 22 вересня 2022 року тривалістю 42 дні.. Для групування було відібрано великоротого окуня без поверхневих пошкоджень, здорового та жвавого, 60 риб заселяли в кожну акваріумну культуру, годували двічі на день, час годування становив 07:00 ранку та 16:00 дня, щоденна кількість годування становила приблизно 1,0%~1,5% від загальної маси тіла риби. Початкова маса тіла піддослідної риби становила (20,46 ± 0,46) г.
1.5 Збір проб
Проби води з резервуару біофільтра відбирали кожні 2 дні, записуючи такі показники, як температура води, розчинений кисень, значення рН, а також вимірювали аміачний і нітритний азот. Реєстрували кількість корму, масу тіла риби на початку та в кінці експерименту та виживаність. Після експерименту 1 л води з кожного культурального резервуару було зібрано за допомогою стерильних мішків для збору води, відфільтровано через фільтрувальну мембрану 0,22 мкм і зберігається в морозильній камері при температурі -80 градусів для подальшого використання. Зразки біофільтрувального середовища по 0,5 г відбирали в асептичних умовах з кожного резервуара біофільтра, зберігали в стерилізованій дистильованій воді, енергійно струшували, щоб видалити мікроорганізми з поверхні біоплівки, потім фільтрували через фільтруючу мембрану 0,22 мкм і зберігали в морозильній камері -80 градусів для подальшого використання.
1.6 Методи вимірювання
1.6.1 Вимірювання якості води
Температуру води, розчинений кисень і значення pH визначали за допомогою aПортативний аналізатор якості води HACH Hq40d. Концентрацію аміачного азоту вимірювали спектрофотометричним методом реактиву Несслера. Концентрацію нітритного азоту визначали спектрофотометричним методом солянокислої нафтилетилендіаміну.
1.6.2 Вимірювання ефективності аквакультури
Формули розрахунку швидкості набору ваги, коефіцієнта конверсії корму та виживання риби такі.
l Швидкість збільшення ваги= (кінцева маса тіла риби - початкова маса тіла риби) / початкова маса тіла × 100%;
l Коефіцієнт конверсії корму= Споживання корму / Приріст ваги;
l Рівень виживання= (Кількість риб наприкінці експерименту / Початкова кількість риб на початку експерименту) × 100%.
1.6.3 Мікробне високо{1}}пропускне секвенування
Бактеріальну ДНК екстрагували з води та біоплівки за допомогою набору Bacterial DNA Extraction Kit (OMEGA Biotech, США). Специфічні праймери 338F (5'–ACTCTACGGGAGGCAGCAG–3') і 806R (5'–GGACTACHVGGGTWTCTAAT–3') використовували для ампліфікації областей V3 і V4 бактеріальної 16S рДНК. Для ПЛР використовували реакційну систему TransGen AP221-02: 4 мкл буфера 5×FastPfu, 2 мкл 2,5 ммоль/л dNTP, 0,4 мкл полімерази FastPfu, по 0,8 мкл кожного з 5 мкмоль/л прямого та зворотного праймерів, 0,2 мкл BSA, 10 нг Шаблон ДНК, доповнений ddH₂O до 20 мкл. Умови реакції ПЛР: 95 градусів протягом 3 хв; 95 градусів за 30 с, 53 градуси за 45 с, 72 градуси за 1 хв, 28 циклів; Розгинання на 72 градуси протягом 10 хв. ПЛР-ампліфікацію проводили на ПЛР-реакційному приладі 9700 (Applied Biosystems® GeneAmp®, США). Продукти ПЛР очищали за допомогою Beads і потім секвенували. Секвенування було доручено Shanghai Majorbio BioPharm Technology Co., Ltd.
1.6.4 Аналіз мікробного різноманіття
Необроблені дані, отримані в результаті секвенування, спочатку об’єднували, а потім проводили фільтрацію контролю якості зчитування та ефект сплайсингу, а також корекцію напрямку послідовності, що призвело до оптимізації даних. Після нормалізації остаточно отриманих чистих даних було проведено кластеризаційний аналіз OTU (Operational Taxonomic Units) і таксономічний аналіз із подібністю 97%. Гістограми зразків були намальовані за допомогою Excel, а теплові карти – за допомогою хмарної платформи Majorbio.
1.7 Аналіз даних
Для аналізу значущості відмінностей було використано статистичне програмне забезпечення SPSS 16.0, а для множинних порівнянь – метод дисперсійного аналізу Дункана (ANOVA).
2. Результати та аналіз
2.1 Час утворення біоплівки з різних біофільтруючих середовищ
Як показано вмалюнок 2,в умовах природного утворення біоплівки вміст аміачного азоту у воді резервуару біофільтра продемонстрував тенденцію швидкого зростання з наступним поступовим зниженням.Вміст аміачного азотуу воді резервуара біофільтра, що відповідає квадратній губці, досяг піку на 17 день, 8,13 мг/л, потім поступово знижувався,досягаючи найнижчого рівня на 41 день, згодом залишаючись приблизно 0,20 мг/л, що вказує на течас формування біоплівки для квадратної губки становив близько 17 днів. Зміни вмісту аміачного азоту у воді резервуарів для біофільтрів, що відповідають Biochip і кулі з киплячим шаром, були в основному однаковими, демонструючи коливальні зміни. Пік вмісту аміачного азоту з’явився через 21 день при 7,88 мг/л і 7,57 мг/л відповідно, що вказує на те, щоЧас утворення біоплівки для Biochip і кулькового біофільтра з киплячим шаром становив приблизно 21 день. Вміст аміачного азотув резервуарах біофільтрів відповідноці два медіа впали до найнижчого рівня на 43 дні та 45 днів відповідно.
2.2 Зміни значення рН води в різних культуральних резервуарах
Відмалюнок 3, можна побачити, що початкове значення рН культуральної води було 7,3. У міру збільшення часу культивування значення рН води в кожному культуральному резервуарі демонструвало тенденцію до зниження. Через 12 днів значення pH у всіх ємностях з культурою було менше 6,0, що є несприятливим для росту культивованих видів.Таким чином, після 12 днів утворення біоплівки слід приділити увагу регулюванню значення рН води культурального резервуару..
2.3 Аналіз складу мікробного співтовариства на біоплівках різних біофільтруючих середовищ і у воді
2.3.1 Склад мікробного співтовариства на рівні типу
Як показано вмалюнок 4,на рівні типу домінуючі бактерії на біоплівках трьох біофільтруючих середовищ були однаковими, всі були Proteobacteria, Actinobacteriota, Bacteroidota та Chloroflexi. Їх загальна відносна кількість становила 68,96%, 64,74% і 65,45% відповідно. Домінуючі бактерії у відповідній культуральній воді були різними. Домінуючою бактерією в W1 була Actinobacteriota з відносною чисельністю 64,66%. Домінуючими бактеріями в W2 і W3 були Proteobacteria з відносною чисельністю 34,93% і 50,10% відповідно.
Рис. 4 Склад спільноти бактерій у різних біоплівках і воді на рівні типу
2.3.2 Склад мікробного співтовариства на рівні родини
Як показано вмалюнок 5, на біоплівках трьох середовищ приблизно 48% бактерій були бактеріальними спільнотами з відносною кількістю менше 3%. Домінуючі бактерії B1 і B2 були однаковими, обидві були Xanthomonadaceae, з відносною чисельністю 11,64% і 9,16% відповідно; домінуючою бактерією B3 була JG30-KF-CM45 з відносною кількістю 10,54%. Домінуючі бактерії у культуральній воді відрізнялися від бактерій на середовищі біофільтра. Microbacteriaceae були абсолютними домінуючими бактеріями в W1, з відносною чисельністю 62,10%; домінуючі бактерії в W2, окрім Microbacteriaceae (13,82%), також включали певну частку Rhizobiales (8,57%); домінуючою бактерією в W3 були Rhizobiales з відносною чисельністю 38,94%, за якою слідували Flavobacteriaceae з відносною чисельністю 15,89%.
Було підраховано 50 найкращих видів на рівні роду. Після обробки числових значень зміни чисельності різних видів у зразках відображалися через градієнт кольорів кольорових блоків. Результати показано вМалюнок 6. Leifsonia була домінуючою бактерією в W1 з відносною чисельністю 56,16%; домінуючими бактеріями в W2 були Leifsonia (10,30%) і Rhizobiales_Incertae_Sedis (8,47%); домінуючою бактерією в W3 була Rhizobiales_Incertae_Sedis з відносною чисельністю 38,92%. Серед бактерій, які можна ідентифікувати на біоплівках, Thermomonas був домінуючим родом у B1 з відносною чисельністю 4,71%; домінуючими родами в B2 і B3 були Nitrospira з відносною чисельністю 4,41% і 2,70% відповідно.
Рис. 5 Склад спільноти бактерій у різних біоплівкахі вода на сімейному рівні
Рис. 6 Теплова карта складу бактеріальної спільноти в різних біоплівках і воді на рівні роду
2.4 -Аналіз різноманітності мікробних спільнот на біоплівках різних біофільтруючих середовищ і у воді
Як показано вТаблиця 1, індекс Шеннона мікробних угруповань на біоплівках різних середовищ був більшим, ніж у відповідної культуральної води, а індекс Сімпсона – протилежним. Аналізуючи відповідну культуральну воду, індекс Шеннона бактеріальної спільноти W2 був найвищим, значно вищим, ніж індекс W1 і W3, тоді як індекс Сімпсона був значно нижчим, ніж індекс W1 і W3, що вказує на те, що його -різноманітність була найвищою. На відміну від -різноманітності культуральної води, хоча індекс Шеннона бактеріальної мікробної спільноти в середовищі B2 був найбільшим, а індекс Сімпсона — найменшим, суттєвої різниці між трьома середовищами для біофільтрів не було. Охоплення секвенування всіх зразків було вище 0,990, що вказує на те, що глибина секвенування може відображати справжній рівень зразків.
2.5 Вплив різних біофільтруючих середовищ на ріст великоротого окуня
Таблиця 2показує ситуацію зростання великоротого окуня в різних групах біофільтрів. Після 44 днів культивування кінцева маса тіла та швидкість збільшення ваги великоротого окуня в групі культивування квадратної губки були значно вищими, ніж у групах із кулькою з псевдозрідженим шаром і біочіпом, а коефіцієнт конверсії корму був значно нижчим, ніж у інших групах. Рівень виживання великоротого окуня в кожній групі був вище 97%, без істотної різниці між групами.
3. Висновки та обговорення
3.1 Час утворення біоплівки з різних біофільтруючих середовищ
Біоплівки прикріплюються до поверхні біофільтруючого середовища. Матеріал, структура та питома поверхня біофільтруючого середовища є основними факторами, що впливають на формування біоплівки. Існує два поширених методи культивування біоплівки: метод формування природної біоплівки та метод формування інокульованої біоплівки. Різні методи формування біоплівки впливають на час дозрівання біоплівки. Ху Сяобін та ін. використовували чотири різні методи для утворення біоплівки, і результати показали, що при використанні таких методів, як додавання хітозану, іонів заліза та інокуляція викинутим мулом для утворення біоплівки, час дозрівання біоплівки був коротшим, ніж у методі утворення природної біоплівки. Хоча додавання корисних мікроорганізмів або активних речовин може скоротити час утворення біоплівки, існують такі проблеми, як складність отримання інокулята, складна конструкція процесу та висока вартість. Guan Min та ін. в умовах низького вмісту органічних речовин безпосередньо використовували сиру воду для утворення біоплівки, і резервуар біофільтра успішно запустився шляхом утворення природної біоплівки приблизно через 38 днів. Цей результат дослідження схожий на результати цього дослідження. Результати цього дослідження показують, що за однакових умов утворення біоплівки час утворення біоплівки квадратної губки був коротшим, ніж у двох інших біофільтруючих середовищах. Це може бути пов'язано з великою питомою поверхнею, сильною гідрофільністю та легкістю прикріплення біоплівки квадратної губки. Питома площа поверхні квадратної губки становить 32 000 ~ 35 000 м²/м³, що набагато більше, ніж у двох інших середовищах. Крім того, матеріалом квадратної губки є поліуретан, який розширюється під впливом води, має високу гідрофільність і сприяє прикріпленню та росту мікроорганізмів у воді. Результати досліджень Li Yong et al. також показали, що продуктивність-запуску та продуктивність видалення аміачного азоту поліуретанової губки була кращою, ніж поліпропіленової, що узгоджується з результатами цього дослідження. Крім того, у цьому дослідженні питома площа поверхні біофільтрувального середовища Biochip досягала 5500 м²/м³, що набагато більше, ніж у кулькового біофільтра з псевдозрідженим шаром, але час утворення біоплівки був в основному таким самим, як і для кулькового біофільтра з псевдозрідженим шаром. Це може бути пов’язано з розміром пор. Деякі дослідження вказують на те, що внутрішній просторовий масштаб середовища для біофільтрів впливає на ріст біоплівок. Хоча деякі біофільтруючі середовища мають велику питому площу поверхні, їхні пори тонкі, а розмір пор набагато менший за товщину зрілої біоплівки, що може легко призвести до блокування пор, що ускладнює досягнення максимального накопичення біоплівки в порах. Пори Biochip малі, що призводить до повільнішого росту біоплівки та довшого часу її утворення.
3.2 Склад мікробного середовища біофільтрувального середовища та культуральної води
У цьому дослідженні домінуючі бактерії на середовищі біофільтра та у відповідній культуральній воді були різними. Індекс Шеннона біоплівок на середовищі біофільтра був більшим, ніж індекс відповідної культуральної води, що вказує на те, що середовище біофільтра має ефект збагачення мікроорганізмів. Це узгоджується з результатами дослідження Hu Gaoyu et al. Існує багато факторів, що впливають на структуру мікробного співтовариства, наприклад, тип носія, глибина фільтра, солоність, концентрація органічних речовин тощо. Одне середовище біофільтру в різних умовах культивування матиме різні мікробні спільноти на біоплівці. Автор одного разу досліджував ситуацію з утворенням біоплівки в середовищі кулькового біофільтра з киплячим шаром у рециркуляційній системі аквакультури для гігантських прісноводних креветок (Macrobrachium rosenbergii). Результати показали, що домінуючим типом на його біоплівці були Firmicutes, тоді як у цьому дослідженні домінуючим типом на біоплівці кульки з киплячим шаром були Proteobacteria. Основною причиною цієї різниці можуть бути різні середовища аквакультури. Три біофільтруючі середовища, використані в цьому дослідженні, мали однакові початкові умови для культивування біоплівок. Можливо, що через різні фізичні характеристики середовищ товщина сформованої біоплівки та внутрішнє середовище також були різними, що призвело до відмінностей у мікробних спільнотах. Отже, різниця в носіях є основною причиною відмінностей мікробних спільнот. Крім того, під час процесу аквакультури водне середовище та мікробна спільнота впливають один на одного. Причини відмінностей у спільнотах мікробів можуть бути пов’язані з факторами навколишнього середовища. Наприклад, дослідження Юань Куйліня показали, що загальна кількість гетеротрофних бактерій в організмі; Fan Tingyu та ін. вважали, що значення рН може суттєво впливати на загальний вміст азоту у воді та відіграє ключову роль у розподілі водних бактеріальних спільнот у внутрішніх ділянках річок. Азот аміачний, загальний фосфор і хлорофіл а також різною мірою впливають на склад бактеріальних угруповань у водоймі. Фактори навколишнього середовища, що викликають відмінності у складі мікробного співтовариства в цьому дослідженні, все ще потребують подальшого підтвердження.
3.3 Вплив різних біофільтруючих середовищ на ріст великоротого окуня
Судячи з результатів зростання, ротовий окунь у групі квадратної губки ріс найшвидше, швидкість набору ваги була значно вищою, ніж у двох інших середовищах, і найнижчий коефіцієнт конверсії корму. Це узгоджується з результатами попередніх досліджень. У цьому дослідженні утворення біоплівки та аквакультура проводилися одночасно. Судячи з часу утворення біоплівки, біоплівка квадратної губки дозрівала раніше, і після дозрівання біоплівки концентрації аміачного азоту та нітритного азоту у воді завжди були нижчими, ніж у двох інших середовищах. Крім того, квадратна губка має певну фільтраційну здатність, вміст твердих зважених речовин у культуральній воді був нижчим, і вода була відносно чистою. Кращий ріст великоротого окуня в групі квадратних губок може бути пов’язаний з хорошою якістю води. Однак вплив квадратної губки на загальний азот, загальний фосфор і перманганатний індекс у воді потребує подальшого вивчення. Варто зазначити, що під час експерименту значення pH показало загальну тенденцію до зниження. Після 12 днів культивування значення pH у всіх культуральних ємностях було менше 6,0, що узгоджується з результатами досліджень Zhang Long та ін. Зменшення значення pH пояснюється тим, що в процесі культивування біоплівки утворюється велика кількість іонів водню, що призводить до зниження значення pH води. Таким чином, під час процесу формування біоплівки необхідно негайно відрегулювати значення рН води культурального резервуару, щоб переконатися, що воно знаходиться в межах нормального діапазону росту культивованих видів. Враховуючи економічні витрати, ринкова ціна квадратної губки становить 70~100 юанів/кг, а її вартість знаходиться між двома іншими біофільтруючими засобами. У поєднанні з результатами зростання, у короткостроковій перспективі, квадратна губка є відносно практичним біофільтруючим середовищем для очищення води для рециркуляційної аквакультури. Однак квадратна губка має низьку міцність і малий термін служби. Його -довготривале використання та вплив на аквакультуру потребують подальшої перевірки.
Таким чином,за природних умов утворення біоплівки біофільтр із квадратної губки має найкоротший час утворення біоплівки, помірну ціну, а кінцева маса тіла та швидкість збільшення ваги великоротого окуня в групі квадратної губки були значно вищими, ніж у двох інших біофільтрів. У короткостроковій перспективі це відносно практичний біофільтр для очищення води для рециркуляційної аквакультури.